Fundamentos de Engenharia Genética

O objectivo da engenharia genética consiste em isolar e transferir genes, responsáveis pela produção de certas substâncias (por exemplo, as proteínas), para outros seres vivos que não produziam estas substâncias, de modo a serem funcionais nestes seres.

Na base da engenharia genética estão as enzimas de restrição. As enzimas de restrição são capazes de reconhecer pequenas sequências especificas de nucleótidos, cortando a molécula de DNA apenas nesses locais.

DNA Recombinante

Nesta técnica recorre-se a enzimas de restrição para cortar o em fragmentos manipuláveis que contêm o gene pretendido. os fragmentos obtidos são incorporados num vector, isto é, numa molécula capaz de transportar o fragmento de DNA para célula. Para que o fragmento de DNA estranho seja incorporado no vector, é necessário que a mesma enzima de restrição que actuou sobre esse DNA actue sobre o vector de forma a expor uma sequência nucleótidica complementar. os dois segmentos de DNA são ligados por acção da enzima DNA ligase, produzindo um nova molécula estável.
Este processo permite não só a produção da substancia codificada pelo gene inserido, como também a clonagem desse gene. As cópias conservadas desse genes constituem uma biblioteca de genes.

DNA complementar

As bibliotecas de genes podem podem, também, ser conseguidas através da produção de DNA complementar. O seu nome resulta do facto de este DNA ser obtido a partir do mRNA por complementaridade. 
A produção do cDNA é possível devido à acção da enzima transcriptase reversa. Esta enzima permite produzir DNA a partir de uma molécula de mRNA maturado.

Após a formação da primeira cadeia de cDNA, a DNA polimerase permite a formação da cadeia complementar, constituindo-se uma molécula estável.

PCR

Esta técnica permite fazer várias cópias a partir de um só fragmento de molécula. Desta forma, procede-se à amplificação dessa porção do DNA, o que é importante quando a amostra de Dna que se possui para a analise é muito reduzida.

Noticia sobre o cancro

Como nem tudo pode ser mau aqui fica uma noticia positiva sobre o cancro...

Rastreio acabou com a mortalidade do cancro colo-rectal em Gaia

por DN.pt23 Fevereiro 2011

Um programa de rastreio de cancro colo-rectal permitiu acabar com a mortalidade deste tipo de cancro no concelho de Vila Nova de Gaia. De acordo com dados avançados pelo Centro Hospitalar Gaia/Espinho, em quatro anos a mortalidade passou de 30 para 0%.

O mérito é de um projecto de rastreios, lançado em 2006 pelo Serviço de Gastrenterologia do Centro Hospitalar Gaia/Espinho, em colaboração com os centros de saúde de Gaia, e que permitiu rastrear cerca de 3092 pessoas.

De todos os utentes analisados, apenas 38% não apresentava qualquer problema gastro-intestinal. Este programa permitiu ainda detectar 26 cancros, todos eles tratados com sucesso.

De acordo com os responsáveis deste centro hospitalar, em 3092 pessoas rastreadas, 1174 (38%) apresentava pólipos, um dos sinais mais ligados ao cancro colo-rectal, dos quais 375 pessoas estavam em risco de progressão para cancro.

Dos 26 cancros detectados, todos foram tratados com sucesso (19 por cirurgia e sete por endoscopia).

Fonte aqui.

Cancro

Esta doença é uma consequência do descontrole no crescimento das células. As células passam-se a multiplicar muito rapidamente, com tendência a invadir órgãos e também produzir metástases, isto é, a reproduzir-se em locais distantes do seu local de origem.

Características das células cancerosas:

• são pouco especializadas e com forma arredondada;
• dividem-se continuamente;
• invadem os tecidos adjacentes;
• podem instalar-se noutros locais do organismo, onde chegam através da corrente sanguínea ou linfática, originando novos tumores que se chamam metástases.

Na maior parte das situações, as mutações ocorrem em células somáticas ao longo da vida, embora também possam ocorrer em células germinativas. Geralmente, é um acumular de mutações que desencadeia o desenvolvimento de um cancro.

Genes relacionados com o aparecimento de cancro:

• Oncogenes:
• Resultam da mutação de proto-oncogenes.
• Os proto-oncogenes codificam proteínas que estimulam o crescimento e a divisão celular e têm uma função essencial nas células normais, por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário e na reparação de tecidos lesados.
• Quando indevidamente activados, promovem uma proliferação celular excessiva que conduz ao desenvolvimento de um cancro.
• A activação de um oncogene pode resultar de diferentes tipos de mutações:

• Substituição de bases no DNA, e consequente alteração na sequência de aminoácidos da proteína formada, que resulta numa proteína com maior actividade ou resistente à degradação;
• Amplificação do proto-oncogene - Traduz-se numa maior quantidade do produto codificado pelo gene;
• Inversões ou translocações que levam à alteração do local que o proto-oncogene ocupa no genoma. Se o proto-oncogene for deslocado para junto de um gene activamente transcrito ou para junto de um DNA viral, a sua taxa de transcrição também aumenta.

• Genes supressores de tumores:
• Os produtos destes genes inibem a divisão celular, impedindo que as células se multipliquem descontroladamente.
• Os genes supressores de tumores podem estar na origem do cancro quando sofrem mutações como as seguintes:

• delecções, que causam a sua perda;
• substituição de bases do DNA que resulta numa proteína onde se verifica perda de função relativamente à proteína normal.

• Genes que codificam proteínas reparadoras do DNA:
• As mutações nestes genes permitem a acumulação de outras mutações, algumas das quais em proto-oncogenes ou genes supressores de tumores.

Os agentes mutagénicos podem activar oncogenes ou desactivar genes supressores de tumores e causar cancro.

As infecções por vírus contribuem para o aparecimento de cancro pela integração do material genético do vírus no DNA das células afectadas. O DNA viral pode ser inserido num local onde destrua a actividade de um gene supressor de tumores ou converta um proto-oncogene num oncogene.

Regulação do Material Genético

Mutações Cromossómicas

As mutações cromossómicas ocorrem ao nível dos cromossomas, envolvendo alteração de grandes quantidades de genoma por exemplo em cromossomas ou até grupos destes. Podemos distinguir dois grandes grupos conforme a alteração seja qualitativa ou quantitativa, assim, as alterações podem ser estruturais quando afectam a estrutura de um ou mais cromossomas e podem ser alterações numéricas quando afectam o número de cromossomas. 

Mutações Cromossómicas Estruturais

São alterações que afectam a estrutura de um ou mais cromossomas, podendo ocorrer de várias formas. São elas: 

 Delecção- Quando se perde uma parte do material genético. 

 Duplicação- Quando se dá a repetição de um segmento originando uma leitura dupla de genes. 

Inversão- Quando um segmento sofre uma quebra e regressa invertido à sua posição original.

Translocação – Ocorre quando há transferência de porções de genes. A translocação pode ser simples ou recíproca. Na translocação simples há transferência de uma porção de genes para um cromossoma não homólogo. Na translocação recíproca (a mais comum) há trocas entre dois cromossomas não homólogos.

Exemplo

Síndrome de "Cri-du-Chat"

Os portadores desta síndrome possuem um choro semelhante ao miado agudo dos gatos, daí também ser conhecida como síndrome do choro do gato.
É uma anomalia cromossómica, causada pela delecção (perda) parcial do braço curto do cromossoma 5, apresentando um cariótipo 46,xx,5p- e 46,xy,5p-. é por isso que esta síndrome também é conhecida como delecção do cromossoma 5p ou síndrome do menos.
Esta síndrome afecta 1 em cada 50000 crianças em todo o mundo, e 196 indivíduos com retardamento mental.

Na maioria das vezes a síndrome não é herdada pelos pais. Em 85% dos casos resultam de novas delecções esporádicas, enquanto que 5% dos casos resultam de uma segregação desigual de uma translocação parental. As pessoas que sofrem uma translocação normal são perfeitamente normais pois não houve perdas do material genético, sendo apenas portadores.

Cariótipo Normal

Cariótipo "Cri-du-Chat"

Mutações Cromossómicas Numéricas

São alterações na quantidade de cromossomos das células, em que lotes inteiros podem ser encontrados em excesso ou em falta (euploidias), ou apenas um par pode estar comprometido, com a presença ou ausência de componentes (aneuploidias).

Euploidias: 

Envolve a alteração completa do genoma. A euploidia pode ser:

• Haploidia – perda de metade do material genético, em que o indivíduo passa a possuir n cromossomas. Os indivíduos resultantes são, no geral, estéreis, devido a irregularidades na meiose, decorrentes da dificuldade de emparelhamento cromossómico.
• Poliploidia – ganho de material genético, em que o indivíduo passa a possuir x.2n cromossomas.

Aneuploidia

Existem cromossomas a mais ou a menos em relação ao número normal. Geralmente envolve apenas um único par de cromossomas e pode ser autossómica ou heterossómica. A aneuploidfia pode ser:

• Nulissomia – faltam os dois cromossomas de um par de homólogos (2n-2). Se afectando o par sexual no homem, a nulissomia é letal.
• Monossomia – ausência de um dos homólogos num dado par (2n-1).
• Polissomia – um ou mais cromossomas extra.

Exemplo

Trissomia 21 ou Síndrome de Down

Como o nome indica é um aumento de um cromossoma no cromossoma 21. Alteração genética que acarreta um atraso do desenvolvimento, tanto nas funções motoras como nas funções mentais

o De cada 700 bebés 1 tem síndrome de Down.

Mutações Génicas

As mutações génicas são as que alteram a informação de um gene através da adição, substituição ou perda de bases, alterando ou não uma sequência de aminoácidos codificada pelo gene, ou impedindo que essa sequência seja produzida.

As mutações génicas são a de substituição (troca de um nucleotídeo por outro), a adição ( introdução de um nucleotídeo suplementar) e a deleção ( perda de um nucleotídeo).

Substituição: Ocorre a troca de um ou mais pares de bases. Chama-se transição a substituição de uma purina por outra ou de uma pirimidina por outra e transversão a substituição de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa.

Adição: Acontece quando uma ou mais bases são adicionadas ao DNA, modificando a ordem de leitura da molécula durante a replicação ou a transcrição.

5’ ATT CGA TAT TCA 3’   ----»     5’ ATT CGC ATA TTC A 3’

Deleção: Acontece quando uma ou mais bases são retiradas do DNA, modificando a ordem da leitura, durante a replicação ou a transcrição.

Quando o número de bases envolvidas não é múltiplo de três, a mutação altera a leitura da tradução a partir do ponto de mutação resultando numa uma proteína com sequência de aminoácidos diferentes.

Quando o número de bases envolvidas é múltiplo de três, a mutação resulta numa proteína com a adição ou falta de aminoácidos.

Mutações

Mutação – qualquer modificação ou alteração brusca de genes ou de cromossomas, podendo provocar uma variação hereditária ou uma mudança no fenótipo. A mutação pode produzir uma característica favorável num dado ambiente e desfavorável noutro.


Classificação das mutações:

• Génicas – alteram a sequência de nucleótidos do DNA, por substituição, adição ou remoção de bases. Podem conduzir à modificação da molécula de RNAm que é transcrita a partir do DNA e, consequentemente, à alteração da proteína produzida, o que tem, geralmente, efeitos no fenótipo.
• Cromossómicas – traduzem-se numa alteração da estrutura (mutação cromossómica estrutural) ou do número (mutação cromossómica numérica) de cromossomas. Podem afectar uma determinada região de um cromossoma, um cromossoma inteiro ou todo o complemento cromossómico de um indivíduo.
  
  

Podem ocorrer:

• Mutação nas células somáticas – ocorre durante a replicação do DNA que precede uma divisão mitótica. Todas as células descendentes são afectadas, mas podem localizar-se apenas numa pequena parte do corpo. As mutações somáticas estão na origem de certos cancros. Não são transmitidas à descendência.
• Mutação nas células germinativas – ocorre durante a replicação do DNA que precede a meiose. A mutação afecta os gâmetas e todas as células que deles descendem após a fecundação – é transmitida à descendência

                As mutações são importantes do ponto de vista evolutivo. São as mutações que dão origem à variabilidade de indivíduos de uma população sobre a qual actua a selecção natural.

As mutações podem ocorrer espontaneamente ou podem ser induzidas por exposição a um agente mutagénico.

• Mutações espontâneas:

• Podem ocorrer devido:
  - Ao facto de que as quatro bases nucleotídicas podem existir sob duas formas diferentes, uma usual e outra muito rara. Quando uma base adquire, temporariamente, a sua forma rara, pode emparelhar-se com uma base diferente.
  - A erros na replicação do DNA motivados pela DNA polimerase. Quase sempre estes erros são reparados durante o processo de replicação do DNA, contudo, alguns persistem.
  - A erros na meiose ou mitose (não disjunção de homólogos ou cromatídeos, tendo como consequência a formação de células com excesso ou falta de cromossomas).

• Onde ocorrem? Podem ocorrer em qualquer gene e em qualquer local do gene, no entanto:
  - São mais frequentes em regiões com sequências de DNA repetitivas ou simétricas, os chamados pontos quentes. Nestes locais, aumenta o risco de uma cadeia de DNA emparelhar consigo própria durante a replicação;
  - São mais frequentes em genes de maior tamanho, que, assim, têm uma maior probabilidade de sofrer alterações na sua sequência de bases;
  - São mais frequentes em genes do genoma mitocondrial que não tem mecanismos de reparação do DNA.

• Mutações induzidas:

• Agentes mutagénicos – substâncias químicas ou radiações que aumentam a probabilidade de ocorrência de mutações.
• Principais agentes mutagénicos:
  - Fontes naturais de radiação como raios cósmicos, luz solar e minerais radioactivos da crosta terrestre. Certos minerais da crosta (urânio, rádio, carbono 14...) emitem radiações ionizantes, os raios α, β e γ. Estas radiações, especialmente os raios γ, têm energia suficiente para remover electrões dos átomos e quebrar o esqueleto de açucares e fosfato do DNA;
  - Substâncias químicas, como agentes aquilantes, acridinas, drogas usadas em quimioterapia, nitrosaminas e nitrito de s´ódio.

• Formas de actuação dos agentes mutagénicos:
  - Alteração das bases nucleotídicas por agentes químicos. No caso do ácido nítrico e dos seus derivados, podem transformar a citosina presente no DNA, na sua forma rara; para tal, ocorre a conversão de -NH2 em =NH. Tem por consequência a alteração do emparelhamento das bases;
  - Adição de grupos químicos às bases por agentes químicos, como, por exemplo, o benzopireno, um dos componentes do fumo do tabaco, que adiciona um grupo químico à guanina, tornando-a indisponível para o emparelhamento das bases;
  - Danificação do material genético por radiações. As radiações ionizantes (raios X) produzem radicais livres, altamente reactivos, e que podem alterar as bases do DNA para formas não reconhecíveis, ou causar anormalidades cromossómicas. As radiações ultravioletas do Sol são absorvidas pela timina do DNA, promovendo o estabelecimento de ligações covalentes entre bases adjacentes, o que causa grandes problemas durante a replicação do DNA.